核酸分离与纯化的步骤:酶作用:主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶) 以使细胞破裂,核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质,促进核酸的分离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-(1 ,4) 键水解。蛋白酶K能催化水解多种多肽键,其在65 ℃及有EDTA、尿素(1~4mol/ L) 和去污剂(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在时仍保留酶活性,这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。在实际工作中,酶作用、机械作用、化学作用经常联合使用。具体选择哪种或哪几种方法可根据细胞类型、待分离的核酸类型及后续实验目的来确定。核酸提取仪需要注意的事项:更换元件或进行机内调节必须有持证的专业维修人员完成。上海自动核算提取试剂盒供应商
核酸的物理性质:①黏性:DNA的高轴比等性质使得其水溶液具有高黏性,很长的DNA分子又易于被机械力或超声波损伤,同时黏度下降。② 浮力密度:可根据DNA的密度对其进行纯化和分析。在高浓度分子质量的盐溶液(CsCl)中,DNA具有与溶液大致相同的密度,将溶液高速离心,则CsCl趋于沉降于底部,从而建立密度梯度,而DNA较终沉降于其浮力密度相应的位置,形成狭带,这种技术成为平衡密度梯度离心或等密度梯度离心。③稳定性:核酸的结构相当稳定,其主要原因有1、碱基对间的氢键2、碱基的堆积作用3、环境中的阳离子。自动核酸提取批发厂家核酸提取纯化原则和要求:核酸样品中不应存在对酶有克制作用的有机溶剂和高浓度的金属离子。
裂解步骤:裂解步骤包括裂解细胞或病原体以及核酸结合到磁珠上两个步骤。1. 样本裂解是核酸提取过程中很关键的一步,只有充分裂解了细胞或病原体,才能释放里面的核酸。病原体样本类型复杂多样,不同样本裂解的难易程度也有差异,样本裂解是否充分直接关系到后续的核酸得率。提高裂解效率可从裂解液成分、裂解温度和时间去考虑。裂解液成分:对于一些难裂解的样本,可以通过提高胍盐浓度以及表面活性剂浓度来增强裂解液的裂解能力。胍盐和表面活性剂可以促使蛋白变性,破坏细胞膜,使核酸和蛋白解离,从而释放更多的核酸。裂解温度和时间:提高温度和增加裂解时间可以让细胞裂解更彻底,得到更多核酸,需要摸索合适的温度和时间;温度过高或时间过长,也有可能导致核酸断裂或醇类挥发导致的提取效率下降。
为了保证分离核酸的完整性和纯度,在实验过程中,应注意以下事项:1. 尽量简化操作步骤,缩短提取过程,以减少各种有害因素对核酸的破坏;2.减少化学因素对核酸的降解,为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏,操作多在pH4-10的条件下进行。3.防止核酸的生物降解,细胞内或外来的各种核酸酶消化核酸链中的磷酸二酯键,直接破坏核酸的一级结构,其中DNA酶,需要金属二价离子Mg2 、Ca2 的启动,使用EDTA、柠檬酸盐螯合金属二价离子,基本可以克制DNA酶活性。而RNA酶不但分布普遍,极易污染样品,而且耐高温、耐酸、耐碱、不易失活,所以是生物降解RNA提取过程的主要危害因素。磁珠法核酸提取技术是以纳米生物磁珠为载体的一种新型核酸提取技术。
全自动核酸提取工作原理:样本裂解是核酸提取过程中很关键的一步,只有充分裂解了细胞或病原体,才能释放里面的核酸。病原体样本类型复杂多样,不同样本裂解的难易程度也有差异,样本裂解是否充分直接关系到后续的核酸得率。提高裂解效率可从裂解液成分、裂解温度和时间去考虑。裂解液成分:对于一些难裂解的样本,可以通过提高胍盐浓度以及表面活性剂浓度来增强裂解液的裂解能力。胍盐和表面活性剂可以促使蛋白变性,破坏细胞膜,使核酸和蛋白解离,从而释放更多的核酸。裂解温度和时间:提高温度和增加裂解时间可以让细胞裂解更彻底,得到更多核酸,需要摸索合适的温度和时间;温度过高或时间过长,也有可能导致核酸断裂或醇类挥发导致的提取效率下降。核酸提取仪需要注意的事项:避免灰尘或纤维在进风口聚集。全血核算提取设备直销
磁珠法核酸提取过程中的常见误区:洗涤次数越多,提取效果越好。上海自动核算提取试剂盒供应商
核酸的化学性质:①酸效应:在强酸和高温,核酸完全水解为碱基,核糖或脱氧核糖和磷酸。在浓度略稀的的无机酸中,较易水解的化学键被选择性的断裂,一般为连接嘌呤和核糖的糖苷键,从而产生脱嘌呤核酸。②碱效应1. DNA:当PH值超出生理范围(pH7~8)时,对DNA结构将产生更为微妙的影响。碱效应使碱基的互变异构态发生变化。这种变化影响到特定碱基间的氢键作用,结果导致DNA双链的解离,称为DNA的变性2.RNA:PH较高时,同样的变性发生在RNA的螺旋区域中,但通常被RNA的碱性水解所掩盖。这是因为RNA存在的2`-OH参与到对磷酸脂键中磷酸分子的分子内攻击,从而导致RNA的断裂。③化学变性:一些化学物质能够使DNA/RNA在中性PH下变性。由堆积的疏水剪辑形成的核酸二级结构在能量上的稳定性被削弱,则核酸变性。上海自动核算提取试剂盒供应商