p65免疫荧光检查

免疫荧光技术又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展较早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。免疫荧光技术是标记免疫技术中发展较早的一种．它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。Coons等于1941年初次采用荧光素进行标记抗体获得成功。经过几十年的发展，该技术已相当成熟。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术。在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯将荧光抗体技术称为免疫荧光技术免疫荧光技术在生物学研究、医学诊断和药物开发等领域具有普遍应用。p65免疫荧光检查

细胞免疫荧光实验注意事项：根据所检测抗原所在位置来确认是否需要加入 Triton 进行通透。若所检测抗原表位位于膜蛋白的白外段，则不需要通透；一般 5% BSA 封闭即可达到效果；从加荧光二抗起，后面所有操作步骤尽量避光。缩短在荧光显微镜下的观察时间，1~2 h 为宜。染色后尽快荧光显微镜下观察，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。无/弱染色：烤片温度过高，推荐 56~60 ℃ 1~2 h；一抗是否适用固定液和石蜡切片，使用浓度是否过低，孵育是否时间过短等。LC3免疫荧光试验免疫荧光技术在免疫学研究中发挥重要作用，帮助揭示细胞和分子的功能和相互关系。

免疫荧光技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。国外生产的TDM用试剂盒，有相当一部分即属于此类，并且还有TDM荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产。由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。新发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。

免疫荧光注意事项：对照实验的设置：1、内源性组织背景对照：某些细胞和组织可能有固有的生物学性质，会产生背景荧光，对结果产生影响，例如色素脂褐质。因此在孵育一抗前，应对样品进行观察，确保抗原本身没有信号。2、阳性对照：用确认含有待测抗原的组织或细胞，与待测标本进行统一处理，结果应为阳性，可证明待测抗原有一定活性并且实验过程中用的试剂及方法均可靠。3、阴性对照：与阳性对照相反，用明确不含有待测抗原的细胞或组织切片染色，结果若为阴性，可排除染色过程中由于非特异性染色造成的假阳性结果。免疫荧光技术可以通过荧光信号显示和检查细胞或组织内的抗原或半抗原物质。

免疫荧光的原理和类型：免疫荧光利用荧光分子或荧光团在一定波长（分子的吸收光谱）下吸收光子的特性，经过短暂的间隔（发射光谱）后以较高的波长发射光子，并伴随能量损失。发射的荧光可通过显微镜观察到。荧光团可以通过可见光或紫外光激发。具有高光稳定性和荧光量子产率的荧光染料可在市场上购买，其激发较大值跨越从400到>700nm的波长范围。它们不会损伤活细胞，可安全用于生物制剂。在进行免疫荧光检测时，首先对细胞或组织进行固定和透化处理。进行免疫染色时，荧光团与目标抗原的抗体结合，然后使用成像显微镜观察荧光信号。根据使用的抗体和所需的信号扩增，免疫荧光可分为直接和间接两种类型。免疫荧光技术可以用于研究细胞内蛋白质的亚细胞定位。p65免疫荧光检查

免疫荧光技术可以用于研究动物模型和药物筛选。p65免疫荧光检查

免疫荧光固定（防止离体组织自溶抗原扩散），固定液包括：有机溶剂（甲醇、乙醇等）；交联剂（4%PFA、10%中性福尔马林），固定液的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性，不过，目前甲醛用的还是较多的，但针对磷酸化的抗体，不适合用甲醛，会导致磷酸蛋白从膜表面转移到胞浆中，故应选择冰冷的无水甲醇或无水乙醇，同时应注意甲醛会挥发，在4-8°C不宜储存太久。固定时间：取决于组合块的大小和类型，对于大多数组织，18-24h较为理想，细胞固定时间较短，一般2%的甲醛室温固定20min即可。以细胞样品为例：用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min。p65免疫荧光检查