Aggrecan免疫检测

细胞免疫荧光实验注意事项：1、建议细胞直接种孔板，采用倒置荧光显微镜拍照，这样可以避免然后挑片时造成划片或细胞片破损以及然后封片可能造成滑片等结果；2、若实验室只有正置荧光显微镜，则需要将细胞植于细胞爬片。建议直接购买处理过的细胞爬片；若只有普通细胞爬片，可以先将爬片于浓酸（浓酸腐蚀性强，注意操作）或 75% 乙醇浸泡过夜，若用酸浸泡过夜，第二天先用自来水小心冲洗掉爬片残留的酸液，若用 75% 乙醇浸泡，则不需要此步骤。然后，用洗洁精搓洗爬片，然后用去离子水清洗爬片。置于烘箱 80 ℃ 烘干，再将爬片置于超净台造紫外消毒后备用。荧光抗体技术具有高灵敏度和高特异性，可以实现精确的免疫检测。Aggrecan免疫检测

免疫荧光法是将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞(或组织)化学技术。免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色)，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位。Aggrecan免疫检测免疫荧光技术可以用于研究细胞凋亡和细胞存活。

细胞免疫荧光实验常见问题:1、信号弱或者无信号：细胞或组织样本保存时间过长；2）抗体浓度不合适，参照抗体说明书的稀释浓度，再根据样本表达量进行摸索；3）一抗孵育时间不合适，建议 4 ℃ 过夜孵育。2、高背景：封闭不充分；抗体浓度过高；抗体孵育时间过长或温度过高；清洗不充分；样本变干，染色过程确保样品始终浸没于液体环境中.3、非特异性染色较多：固定液残留，这里需要缩短固定时间并且在封闭液中加甘氨酸，并且抗原修复也可以帮助解决非特异性染色；二抗残留，二抗需要用带有吐温 20 的 PBS 溶解，只要荧光显微镜的强度还可以增大，那么就可以增加吐温洗脱掉非特异性染色。

荧光标记二抗的选择普遍；与使用荧光素结合一抗的检测相比，成本较低。间接免疫荧光的缺点：由于需要具有两种不同物种反应性的两种抗体，因此物种交叉反应性问题增加；与直接免疫荧光相比，时间更长（操作步骤更多）。间接免疫荧光的优点：通过增加能够与一抗结合的二抗数量进行信号放大；与直接免疫荧光相比，通过信号放大提高检测灵敏度；荧光标记二抗的选择普遍；与使用荧光素结合一抗的检测相比，成本较低。间接免疫荧光的缺点：由于需要具有两种不同物种反应性的两种抗体，因此物种交叉反应性问题增加；与直接免疫荧光相比，时间更长（操作步骤更多）。免疫荧光技术在免疫学研究中发挥重要作用，帮助揭示细胞和分子的功能和相互关系。

其他荧光物质：1．酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基乙酸等。2．镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3+）、铽（Tb3+）、铈（Ce3+）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3+应用较广。Eu3+螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，较适合用于分辨荧光免疫测定。所需要的仪器：荧光显微镜、显微荧光分光光度计、流式细胞仪和时间分辨荧光计等仪器激光共聚焦显微镜。免疫荧光技术可以用于研究细胞内分子的相互作用。Aggrecan免疫检测

免疫荧光技术可以用于研究肉瘤的发生和发展过程。Aggrecan免疫检测

免疫荧光的原理：免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。直接法:将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。Aggrecan免疫检测

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