Itrytoexplainwhytwo-photonmicroscopyhasadeeperimagingdepththanone-photonmicroscopy,intheareaofbiomedicalimaging.Manyofthebiomedicalimagingmodalities,nomatterone-photon(confocal)ormulti-photon(two-photon),uselasersaslightsourceandrequirecompatiblefluorescentdyes.Fluorescentdyeshavetheirownexcitationwavelength,andtheycaneitherbeexcitedbyasinglephotonwiththephotonenergyofthatexcitationwavelength(E=hv=h*c/λ);orbytwophotons,arrivingalmostatthesametime,buteachwithapproximatelyhalfoftheenergy,henceofdoublewavelengththanone-photon(0.5E->2λ).Theformeristheprincipleofone-photonmicroscopyandthelatteristheprincipleoftwo-photonmicroscopy.Whenimagingthesamefluorescentdye,sincetwo-photoncoulduseapproximatelydoubledwavelengthcomparedwithsingle-photon,two-photoncanobviouslypenetrateddeeperintothetissueduetolessscattering(longerwavelength,lessscattering).双光子显微镜是新型的荧光显微镜，其原理大致是这样的；2PPLUS双光子显微镜成像原理
要想让激发激光进入更深的层面，大致可从两个方面入手，装置优化与标本改造。关于装置优化，我们可以把激光束变得更细，使能量更加集中，就能让激光穿透更深。关于标本，其中影响光传播的主要是物质吸收和散射，解决这个问题，我们需要对样本进行透明化处理。一种方法是运用某种物质将标本浸泡，使其中的物质（主要是脂质）被破坏或溶解。另一种方法是运用电泳将脂质电解，让标本“透明度”提高。高光子密度带来的高能量容易损伤细胞，所以双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲达到最大值所持续的周期只有十万亿分之一秒，而其频率可以达到80至100兆赫，这样即能达到双光子激发的高光子密度要求，又能不损伤细胞，使扫描能更好地进行。国内ultimainvestigator双光子显微镜供应商双光子显微镜的应用中，该如何选择以及更好的使用PMT。
像差问题一直困扰着光学领域的工作者。像差会使光波前发生形变，不仅降低成像的信噪比和分辨率，使得很多时候我们只能“雾里看花”，更甚者，产生赝像，或无法获得有意义的图像。像差问题对双光子成像的影响尤为严重，因为在那里，荧光信号对入射光强度的依赖是平方关系，一旦入射光波前形变，不仅聚焦强度大幅下降，成像分辨率也急剧恶化。因此，如何解决像差问题，实现，例如小鼠大脑皮层，深层区域的高质量成像成为光学成像发展中相当有挑战性的问题之一。
双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双（多）光子成像优势在于，具有更深的组织穿透深度，利用红外光，能够在层面检测极限达1mm的组织区域；因信号背景比高，而具有更高的对比度；因激发体积小，具有定点激发的特性，具有更少的光毒性；激发波长由紫外、可见光调整为红外激发，能够更加安全。双光子显微镜在组织透明化成像中应用。
双光子显微镜为什么穿透能力强？因为组织对可见光区域的较强吸收和散射带来两个严重的问题第1个是激发光的减弱，第2个就是另外就是由于物镜本身光的光学特性，单光子激发的背景较强，所以才有共聚焦系统提高成像的分辨率因为组织对可见光区域的较强吸收和散射带来两个严重的问题第1个是激发光的减弱，第2个就是另外就是由于物镜本身光的光学特性，单光子激发的背景较强，所以才有共聚焦系统提高成像的分辨率刚好双光子在这两点具有很大的优势上面的内容基本在谈到双光子优势都会相对说明，在实际操作中成像的深度和样品的关系很大，双光子成像利用高亮度的荧光标记材料，已经有做到mm级别的穿透深度双光子显微镜的探测器,该怎么选用?美国荧光激光双光子显微镜荧光寿命计数
双光子显微镜成像技术及不同转基因小鼠开展对多种脏器的成像研究。2PPLUS双光子显微镜成像原理
双光子显微成像技术不是什么新技术，早在20多年前就有了，目前已经在生命科学和材料科学中广泛应用。几年前双光子过期后，已经推出自己的双光子显微镜的厂家估计不少于10家以上。即便如此，世界上很多实验室都搭双光子，自己搭的好处有很多，首先是便宜，尤其是实验室已经有飞秒激光器，那就更很省钱了。其次是灵活，可以选择针对特殊用途的搭配，改动也灵活。好处就是可以锻炼队伍，一趟走下来可以把新手带出来，后期维护也更加自由。当然坏处也不少，首先是操心，特别是第1次搭的时候，开始要想方案，后来要解决各种实际问题。其次是花时间，加上买配件的时间，比买一台现成的商业化双光子耗时长。现在已经有不少关于如何搭双光子显微镜的文章，各种protocol，大多是老外写的，中文的较少。其实完全自己搭一套好用的系统还是不容易的，尤其是没有经验的时候，容易走弯路，多花钱，也多花时间，再加上双光子的重要器件都需要从国外购买，在国内买这些东西耗时较长。因此，我想总结一下我们的经验，贴出来分享，希望能帮到想自己动手的实验室，2PPLUS双光子显微镜成像原理
