新一代微型化双光子荧光显微成像系统的成功研制是国家重大科研仪器研制专项的一个硕果。它彰显了北京大学在生物医学成像领域先期布局的前瞻性，锻炼了一支以年轻PI和硕博研究生为主体、具有学科交叉背景和重要技术创新能力的“中国智造”队伍。目前，该研发团队正在领衔建设“多模态跨尺度生物医学成像”十三五国家重大科技基础设施，积极参与即将启动的中国脑科学计划。可以期待，微型化双光子荧光显微成像系统将为实现“分析脑、理解脑、模仿脑”的战略目标发挥不可或缺的重要作用在深度组织中以较长时间对细胞成像，双光子显微镜是当前之选。激光荧光双光子显微镜荧光探测
N掺杂可以明显影响碳点（CDs）的发射和激发特性，使双光子碳点（TP-CDs）具有本征双光子激发特性和605 nm的红光发射特性。在638 nm激光照射下，除了长波激发和发射外，还可以实现活性氧（ROS）的产生，这为光动力技术提供了巨大的可能性。更重要的是，通过各种表征和理论模拟证实，掺杂诱导的N杂环在TP-CDs与RNA的亲和力中起关键作用。这种亲和力不仅为实现核仁特异性自我靶向提供了可能，而且通过ROS断裂RNA链解离TP-CDs@RNA复合物，赋予治疗过程中的荧光变异。TP-CDs结合了ROS的产生能力、光动力疗法（PDT）过程中的荧光变化、长波激发和发射特性以及核仁的特异性自靶向性，可以认为是一种结合核仁动态变化实时处理的智能CDs。国外激光双光子显微镜用途双光子显微镜比单光子共聚焦显微镜较大的不同在于无须使用孔限制光学散射；
在深度组织中以较长时间对活细胞成像，双光子显微镜是当前之选。双光子和共聚焦显微镜都是通过激光激发样品中的荧光标记，使用探测器测量被激发的荧光。但是，共聚焦一般使用单模光纤耦合激光器，通过单光子激发荧光，而双光子使用飞秒激光器，通过几乎同时吸收两个长波光子激发荧光。双光子激发荧光的主要优势：双光子比共聚焦使用的更长的波长，所以对组织的损伤更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般为100微米，双光子则能达到250到500微米，甚至超过1毫米。另外，同时吸收两个光子意味只有度聚焦点处能被激发，所以不会损伤焦平面之外的组织，并且生成更清晰的图像。
共聚焦显微可以呈现这么漂亮的图像，是不是什么样品都可以用共聚焦显微镜拍拍拍.....得到各种各样清晰漂亮的图像呢？答案是否定的，任何事物都有优缺点，何况一台仪器呢，共聚焦显微镜也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦显微镜只能拍摄约200um以内的的样品，对于厚的或者样品不能进拍摄；2. 共聚焦显微镜由于是逐点进行扫描，对样品的光毒性还是比较大的，特别是拍摄活细胞样品时就更容易对样品进行淬灭；3. 由于光照射的区域几乎能通过这个Z轴的层面，所以对于空间定点光刺激的实验定点位置就不是特别精确；并且激光共聚焦显微镜没有纯紫外进行激发，对于一些特殊激发波长的实验，效率非常低。双光子显微镜的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有 100 飞秒，而其周期可以达到 80至100兆赫兹。双光子显微镜是新型的荧光显微镜，其原理大致是这样的；
细胞内钙离子作为重要的信号分子其作用具有时间性和空间性。当个细胞兴奋时，产生了一个电冲动，此时，细胞外的钙离子流入该细胞内，促使该细胞分泌神经递质，神经递质与相邻的下一级神经细胞膜上的蛋白分子结合，促使这一级神经细胞产生新的电冲动。以此类推，神经信号便一级一级地传递下去，从而构成复杂的信号体系，终形成学习、记忆等大脑的高级功能。在哺乳动物神经系统中，钙离子同样扮演着重要的信号分子的角色。静息状态下大部分神经元细胞内钙离子浓度约为50-100nM，而细胞兴奋时钙离子浓度能瞬间上升10-100倍，增加的钙离子对于突触囊泡胞吐释放神经递质的过程必不可少。众所周知，只有游离钙才具有生物学活性，而细胞质内钙离子浓度由钙离子的内外流平衡所决定，同时也受钙结合蛋白的影响。细胞外钙离子内流的方式有很多种，其中包括电压门控钙离子通道、离子型谷氨酰胺受体、烟碱型胆碱能受体（nAChR）和瞬时受体电位C型通道（TRPC）等。神经元钙成像的原理就是利用特殊的荧光染料或钙离子指示剂将神经元中钙离子浓度的变化通过荧光强度表现出来，以反映神经元活性。该方法可以同时观察多个功能或位置相关的脑细胞。双光子显微镜为什么穿透能力强?进口荧光双光子显微镜厂家
双光子显微镜可以用于局部微蚀镭射磨皮后的胶原重塑的检测。激光荧光双光子显微镜荧光探测
为了验证动物生物样品的时间分辨成像能力，本实验观察了活海拉细胞高尔基体中的青色荧光蛋白mTFP1，见图3(a),(c)-(i)。使用的物镜及尺寸与荧光颗粒成像一致，对比可见v2PE在空间分辨率、激发深度级图像对比度较常规宽场显微镜都有所提高。此外，v2PE可以同时激发多个波长的荧光蛋白，这种技术还可以应用于细胞内分子的三维动力学多色成像。在此基础上，实验对海拉细胞中的高尔基体(mTFP1)和纤颤蛋白(EGFP)进行了在体成像，见图3(j)-(n)，青色为mTFP1,绿色为EGFP，实验中两种荧光蛋白同时成像，终采用光谱分离法将不同蛋白的荧光信号分离出来。激光荧光双光子显微镜荧光探测
