细胞在受到外界刺激时，随着刺激时间的增长，即使刺激继续存在，Ca2+荧光信号不但不会继续增强，反而会减弱，直至恢复到未加刺激物时的水平。对于细胞受精过程中Ca2+荧光信号的变化情况，研究发现，配了在粘着过程中，Ca2+荧光信号未发生任何变化，而配子之间发生融合作用时，Ca2+荧光信号强度却会出现一个不稳定的峰值，并可持续几分钟。这些现象，对研究受精发育的早期信号及Ca2+在卵细胞和受精卵的发育过程中的作用具有重要的意义。在其它一些生理过程如细胞分裂、胞吐作用等，Ca2+荧光信号强度也会发生很强的变化。利用多光子显微镜的多点光ji活能力，我们可以研究多个神经细胞之间的连接和控制。布鲁克多光子显微镜峰值功率密度
Ca2+是重要的第二信使，对于调节细胞的生理反应具有极其重要的作用，开发和利用双光子荧光显微成像技术对Ca2+荧光信号进行观测，可以从某些方面对有机体或细胞的变化机制进行分析，具有重要的意义。利用双光子荧光显微成像技术可以观察细胞内用荧光探针标记的Ca2*的时间和空间的荧光图像的变化，还可以观察细胞某一层面或局部的（Ca2+）荧光图像和变化。通过对单细胞的研究发现，Ca2+不仅在细胞局部区域间的分布是不均匀的，而且细胞内各局部区域的不同深度或层次间也存在不同程度的Ca2+梯差即所谓的空间Ca2梯差。Ultima Investigator多光子显微镜焦点激发多光子显微镜的分辨率比传统的单光子共聚焦要低的多。
2020年，JianglaiWu等人提出提高2PM横向扫描速率的装置，称为FACED（free-spaceangular-chirp-enhanceddelay）。圆柱透镜将激光束一维聚焦，会聚角为Δθ。光束进入到一对几乎平行的高反射镜中，其间距为S，偏角为α。经过反射镜多次反射后，激光脉冲被分成多个传播方向不同的子脉冲（N=Δθ/α），脉冲间以2S/c的时间延迟（c，光速）回射。FACED模块输出处的子脉冲序列可以看作从虚拟光源阵列发出的光，这些子脉冲在中继到显微镜物镜后形成了一个空间上分离且时间延迟的焦点阵列。然后将该模块并入具有高速数据采集系统的标准双光子荧光显微镜中。光源是具有1MHz重复频率的920nm的激光器，通过FACED模块可产生80个脉冲焦点，其脉冲时间间隔为2ns。这些焦点是虚拟源的图像，虚拟源越远，物镜处的光束尺寸越大，焦点越小。光束沿y轴比x轴能更好地充满物镜，从而导致x轴的横向分辨率为0.82µm，y轴的横向分辨率为0.35µm。
多束扫描技术可以同时对神经元组织的不同位置进行成像。该技术:对于两个远程成像位置(相距1-2mm以上)，通常采用两个**的路径进行成像；对于相邻区域，通常使用单个物镜的多个光束进行成像。多光束扫描技术必须特别注意激发光束之间的串扰，这可以通过事后光源分离或时空复用来解决。事后光源分离法是指分离光束以消除串扰的算法；时空复用法是指同时使用多个激发光束，每个光束的脉冲在时间上被延迟，使不同光束激发的单个荧光信号可以暂时分离。引入的光束越多，可以成像的神经元越多，但多束会导致荧光衰减时间重叠增加，从而限制了分辨信号源的能力；并且复用对电子设备的工作速度要求很高；大量的光束也需要较高的激光功率来维持单束的信噪比，这样容易导致组织损伤。多光子显微镜销售/营销策略建议。
双光子荧光显微成像主要有以下优点∶a.光损伤小∶双光子荧光显微镜使用可见光或近红外光作为激发光，对细胞和组织的光损伤很小，适合于长时间的研究;b.穿透能力强∶相对于紫外光，可见光或近红外光具有很强的穿透性，可以对生物样品进行深层次的研究;c．高分辨率∶由于双光子吸收截面很小P，只有在焦平面很小的区域内可以激发出荧光，双光子吸收局限于焦点处的体积约为λ范围内;d.漂白区域很小，焦点以外不发生漂白现象。e．荧光收集率高。与共聚焦成像相比，双光子成像不需要光学滤波器，提高了荧光收集率。收集效率提高直接导致图像对比度提高。f.对探测光路的要求低。由于激发光与发射荧光的波长差值加大以及自发的三维滤波效果，多光子显微镜对光路收集系统的要求比单光子共焦显微镜低得多，光学系统相对简单。g.适合多标记复合测量。许多染料荧光探针的多光子激发光谱要比单光子激发谱宽阔，这样，可以利用单一波长的激发光同时激发多种染料，从而得到同一生命现象中的不同信息，便于相互对照、补充。多光子显微镜，提高医学病理诊断的准确性和效率。布鲁克多光子显微镜峰值功率密度
多光子显微镜是一种用于生物学领域的分析仪器。布鲁克多光子显微镜峰值功率密度
对于双光子（2P）成像而言，离焦和近表面荧光激发是两个比较大的深度限制因素，而对于三光子（3P）成像这两个问题大大减小，但是三光子成像由于荧光团的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高数量级的脉冲能量才能获得与2P激发的相同强度的荧光信号。功能性3P显微镜比结构性3P显微镜的要求更高，它需要更快速的扫描，以便及时采样神经元活动；需要更高的脉冲能量，以便在每个像素停留时间内收集足够的信号。复杂的行为通常涉及到大型的大脑神经网络，该网络既具有局部的连接又具有远程的连接。要想将神经元活动与行为联系起来，需要同时监控非常庞大且分布普遍的神经元的活动，大脑中的神经网络会在几十毫秒内处理传入的刺激，要想了解这种快速的神经元动力学，就需要MPM具备对神经元进行快速成像的能力。快速MPM方法可分为单束扫描技术和多束扫描技术。布鲁克多光子显微镜峰值功率密度
