双光子吸收理论早在1931年就由诺奖得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因为有了激光才得到实验验证，但是到WinfriedDenk发明双光子显微镜又用了将近30年。要理解双光子的技术挑战和飞秒激光发挥的重要作用，首先要了解其中的非线性过程。双光子吸收相当于和频产生非线性过程，这要求极高的电场强度，而电场取决于聚焦光斑大小和激光脉宽。聚焦光斑越小，脉宽越窄，双光子吸收效率越高。对于衍射极限显微镜，聚焦在样品上的光斑大小只和物镜NA和激光波长有关，所以关键变量只剩下激光脉宽。基于以上分析，能够以高重频(100MHz)输出超短脉冲(100fs量级)的飞秒激光器成了双光子显微镜的标准激发光源。这也再次说明双光子显微镜的优势：只有焦平面处才能形成双光子吸收，而焦平面之外由于光强低无法被激发，所以双光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飞秒激光器(100fs脉宽、630nm可见光波长)。虽然染料激光器对于实验室演示尚可，但是使用很不方便所以远未实现商用。很快双光子显微镜的标配光源就变成了飞秒钛宝石激光器。除了固态光源优势，钛宝石激光器还具有较宽的近红外波长调谐范围，而近红外相比可见光穿透更深，对生物样品损伤更小。双光子显微镜型号有哪些？美国布鲁克双光子显微镜磷光寿命计数
n掺杂可以明显影响碳点(CDs)的发射和激发特性，使双光子碳点(TP-CDs)具有本征双光子激发特性和605nm红光发射特性。在638nm激光的照射下，除了长波激发和发射外，还能产生活性氧，这为光动力技术提供了极大的可能性。更重要的是，各种表征和理论模拟证实了掺杂诱导的N杂环在TP-CDs与RNA的亲和力中起着关键作用。这种亲和力不仅可以实现核仁特异性的自我靶向，还可以通过ROS断裂RNA链来解离TP-CDs@RNA复合物，从而在治疗过程中产生荧光变化。TP-CDs结合了ROS产生的能力、PDT过程中的荧光变化、长波激发和发射特性以及核仁特异性自靶向性，因此可以认为是一种实时处理核仁动态变化的智能CDs。美国ultimainvestigator双光子显微镜磷光寿命计数双光子显微镜为什么穿透能力强?
2008年钱永健等人由于荧光蛋白（GFP，绿色荧光蛋白）的发现和使用，获得了诺贝尔化学奖，是对荧光成像技术的一次巨大肯定和推动。与荧光蛋白以及荧光染料等标记物在细胞中的定位与表达技术相结合，使得科学家可以特异性的分辨生物体乃至细胞内部不同结构与成分，并且能够在生命体和细胞仍具有活性的状态下（状态）对其功能进行动态观察。这就使得荧光成像技术成为了无可替代的，生物学家现今较为重要的技术手段之一。目前，大多数细胞生物学和生理学研究主要还是在离体培养的细胞体系中研究。然而与细胞生物学研究有所不同的是，大脑的功能研究的整体性和原位性显得更加关键：只研究分离的神经元无法解释神经系统的功能和规律。由于被观测的信号会受到样本组织的散射和吸收，根本无法穿透如此深的组织进行成像。而双光子显微镜（Two-photonMicroscopy，简称TPM）的发明，则为此类研究带来了希望。
双光子显微镜是激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术相结合的新技术。双光子激发的基本原理是:在光子密度较高的情况下，荧光分子可以同时吸收两个波长较长的光子，经过短暂的所谓激发态寿命后，发射一个波长较短的光子；效果和用波长为长波长一半的光子激发荧光分子是一样的。双(多)光子成像的优点是具有更深的组织穿透深度，红外光可以在平面上探测到极限为1mm的组织区域；因为信号背景比高，所以具有更高的对比度；由于激发体积小，具有定点激发、光毒性小的特点；激发波长由紫外、可见光调整为红外激发，更加安全。双光子显微镜有哪些分类呢？
使用基因编码的荧光探针可以在突触和细胞分辨率下监测体内神经元信号，这是揭示动物神经活动复杂机制的关键。使用双光子显微镜（2PM）可以以亚细胞分辨率对钙离子传感器和谷氨酸传感器成像，从而测量不透明大脑深处的活动；成像膜电压变化能直接反映神经元活动，目前电压成像主要通过宽场显微镜实现，但它的空间分辨率较差并且只是于浅层深度。因此要在不透明的大脑中以高空间分辨率对膜电压变化进行成像，需要较提高2PM的成像速率。FACED模块输出处的子脉冲序列可以看作从虚拟光源阵列发出的光，这些子脉冲在中继到显微镜物镜后形成了一个空间上分离且时间延迟的焦点阵列。然后将该模块并入具有高速数据采集系统的标准双光子荧光显微镜中，如图2所示。光源是具有1MHz重复频率的920nm的激光器，通过FACED模块可产生80个脉冲焦点，其脉冲时间间隔为2ns。这些焦点是虚拟源的图像，虚拟源越远，物镜处的光束尺寸越大，焦点越小。光束沿y轴比x轴能更好地充满物镜，双光子显微镜明日之星--FemtoFiber ultra 920 。国外ultimainvestigator双光子显微镜成像视野一般是多少
双光子显微镜的性能得到不断地优化，结合它的特点，大致可以分成深和活两个方面的提升。美国布鲁克双光子显微镜磷光寿命计数
在国家自然科学基金委国家重大科研仪器研制专项《超高时空分辨微型化双光子在体显微成像系统》的支持下，北京大学分子医学研究所、信息科学技术学院、动态成像中心、生命科学学院、工学院联合中国人民医学科学院组成跨学科团队，历经三年多的协同奋战，成功研制新一代高速分辨微型化双光子荧光显微镜，并获取了小鼠在自由行为过程中大脑神经元和神经突触活动清晰、稳定的图像。原始论文于5月29日在线发表于自然杂志子刊NatureMethods(IF25.3)，并已申请多项。美国布鲁克双光子显微镜磷光寿命计数
