Ca2+是重要的第二信使，对于调节细胞的生理反应具有重要的作用，开发和利用双光子荧光显微成像技术对Ca2+荧光信号进行观测，可以从某些方面对有机体或细胞的变化机制进行分析，具有重要的意义。利用双光子荧光显微成像技术可以观察细胞内用荧光探针标记的Ca2*的时间和空间的荧光图像的变化，还可以观察细胞某一层面或局部的（Ca2+）荧光图像和变化。通过对单细胞的研究发现，Ca2+不仅在细胞局部区域间的分布是不均匀的，而且细胞内各局部区域的不同深度或层次间也存在不同程度的Ca2+梯差即所谓的空间Ca2梯差。从产品类型及技术方面来看，正置显微镜占据绝大多数市场。美国bruker多光子显微镜原理
针对双光子荧光显微镜的特点，从理论上分析双光子成像特点，并搭建一套时间、空间分辨率高，能实时、动态、多参数测量的双光子荧光显微镜系统。具体系统应实现∶（1）能对不同染料的双光子荧光进行探测;（2）用特定染料对样品标记以后，能实现双光子荧光的三维成像;（3）通过实验的研究，改进双光子荧光显微成像系统;（4）在保证成像质量的前提下，简化整个系统，使得实验操作方便、安全。单光子激发荧光的过程，就是荧光分子吸收一个光子，从基态跃迁到激发态，跃迁以后，能量较大的激发态分子，通过内转换把部分能量转移给周围的分子，自己回到比较低电子激发态的比较低振动能级。处于比较低电子激发态的比较低振动能级像在生物医学光学成像研究中显示了较大的优势。而在显微成像中，双光子荧光显微镜凭其独有的优点，成为研究细胞结构和功能检测的重要工具。美国灵长类多光子显微镜实验由于其非侵入性和高分辨率的特点，多光子显微镜在神经科学、ai症研究、免疫学等领域发挥了重要作用。
通过添加FACED模块，可以将基于标准振镜的现有2PM轻松转换为千赫兹成像系统。FACED双光子荧光显微镜遵循光栅扫描，需要很少的计算处理，在稀疏或密集的标记样本中均可以使用，并且不受串扰的影响，而且对整个图像平面采样后可以进行运动校正。实验中没有观察到光损伤的迹象，此外，子脉冲延迟到达相同的样品位置，能为荧光团提供充足的时间使其从易于破坏的暗态返回到基态，可以明显减少光漂白。使用现有的传感器，FACED双光子荧光显微镜可以提供足够的速度和灵敏度来检测神经元过程中的钙瞬变和谷氨酸瞬变，以及来自细胞体的尖峰和亚阈值电压。该组使用基于FACED的2PM显微镜，在小鼠大脑中实现了千赫兹速率的神经活动成像。在物镜平均激光功率为10-85mW下，他们测量了清醒小鼠中V1神经元的自发性和感觉诱发性的超阈值和亚阈值电位活动。
以往我们认识的光电效应是单光子光电效应，即一个电子在极短时间内能吸收到一个光子而从金属表面逸出。强激光的出现丰富了人们对于光电效应的认识，用强激光照射金属，由于其光子密度极大，一个电子在短时间吸收多个光子成为可能，从而形成多光子电效应，这已被实验证实。为什么一般讨论的光电效应都是指单光子光电效应呢？这是因为，在使用普通光源的情况下，电子吸收两个以上光子能量的概率是非常非常小的，几乎为零。事实上，爱因斯坦本人就考虑过在强光下发生光电效应的可能性问题。对此，他有如下的论述：光电效应中的一个电子吸收两个光子的几率不会大于下雨天两个雨滴同事打在一个蚂蚁上的几率。因此，多光子光电效应在实验上的研究成为可能，是二十世纪六十年代激光乃至强激光出现以后的事情。有了激光，对于双光子光电效应，在实验上和理论上均取得了许多成果。利用强激光，人们不仅观察到双光子和三光子的光电效应，甚至观察到金靶材吸收几十个等效光子实验现象。多光子显微镜，为疾病诊断和药物研发提供强大支持。
在多光子显微镜（也称为非线性或双光子显微镜）中，以两倍正常激发波长照射样品。更长的波长是有利的，因为它们可以更深地穿透样品进行3D成像，并且因为它们不会损坏样品，从而延长样品寿命。为了实现多光子激发，照明光束在空间上聚焦（使用光学器件），同时使用高能短脉冲激发光束以提高两个（或更多）光子同时到达同一位置（即荧光团分子）的概率。多光子显微技术的例子包括二次谐波产生(SHG)、三次谐波产生(THG)、相干反斯托克斯拉曼光谱(CARS)和受激发射耗尽(STED)显微技术。由于这些技术中的每一种都使用脉冲激光器，因此选择能够比较大限度地减少脉冲色散的光学组件很重要，并且激光反射二向色镜应具有低GDD特性。突破光学成像技术的限制，多光子显微镜为科研工作提供新思路。美国灵长类多光子显微镜实验
多光子显微镜的成熟的深部组织成像技术中。还有其他类型的图像对比提供有关样本的有价值信息。美国bruker多光子显微镜原理
细胞在受到外界刺激时，随着刺激时间的增长，即使刺激继续存在，Ca2+荧光信号不但不会继续增强，反而会减弱，直至恢复到未加刺激物时的水平。对于细胞受精过程中Ca2+荧光信号的变化情况，研究发现，配了在粘着过程中，Ca2+荧光信号未发生任何变化，而配子之间发生融合作用时，Ca2+荧光信号强度却会出现一个不稳定的峰值，并可持续几分钟。这些现象，对研究受精发育的早期信号及Ca2+在卵细胞和受精卵的发育过程中的作用具有重要的意义。在其它一些生理过程如细胞分裂、胞吐作用等，Ca2+荧光信号强度也会发生很强的变化。美国bruker多光子显微镜原理
