有许多方法可以实现快速光栅扫描，例如使用振镜进行快速2D扫描，以及将振镜与可调电动透镜相结合进行快速3D扫描。而可调电动式镜头由于机械惯性的限制，无法在轴向快速切换焦点，影响成像速度。现在它可以被空间光调制器(SLM)取代。远程对焦也是实现3D成像的一种手段，如图2所示。LSU模块中，扫描振镜水平扫描，ASU模块包括物镜L1和反射镜M，通过调整M的位置实现轴向扫描该技术不仅可以校正主物镜L2引入的光学像差，还可以进行快速轴向扫描。为了获得更多的神经元成像，可以通过调整显微镜的物镜设计来放大FOV。然而，大NA和大FOV的物镜通常很重，不能快速移动以进行快速轴向扫描，因此大FOV系统依赖于远程聚焦、SLM和可调电动透镜。多光子显微镜，提高样品成像质量，降低样品损害程度。美国高速高分辨率多光子显微镜三维分辨率
对于双光子（2P）成像而言，离焦和近表面荧光激发是两个比较大的深度限制因素，而对于三光子（3P）成像这两个问题大大减小，但是三光子成像由于荧光团的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高数量级的脉冲能量才能获得与2P激发的相同强度的荧光信号。功能性3P显微镜比结构性3P显微镜的要求更高，它需要更快速的扫描，以便及时采样神经元活动；需要更高的脉冲能量，以便在每个像素停留时间内收集足够的信号。复杂的行为通常涉及到大型的大脑神经网络，该网络既具有局部的连接又具有远程的连接。要想将神经元活动与行为联系起来，需要同时监控非常庞大且分布普遍的神经元的活动，大脑中的神经网络会在几十毫秒内处理传入的刺激，要想了解这种快速的神经元动力学，就需要MPM具备对神经元进行快速成像的能力。快速MPM方法可分为单束扫描技术和多束扫描技术。 美国飞秒激光多光子显微镜技术双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。
Ca2+是重要的第二信使，对于调节细胞的生理反应具有重要的作用，开发和利用双光子荧光显微成像技术对Ca2+荧光信号进行观测，可以从某些方面对有机体或细胞的变化机制进行分析，具有重要的意义。利用双光子荧光显微成像技术可以观察细胞内用荧光探针标记的Ca2*的时间和空间的荧光图像的变化，还可以观察细胞某一层面或局部的（Ca2+）荧光图像和变化。通过对单细胞的研究发现，Ca2+不仅在细胞局部区域间的分布是不均匀的，而且细胞内各局部区域的不同深度或层次间也存在不同程度的Ca2+梯差即所谓的空间Ca2梯差。
对于两个远距离(相距1-2mm以上)的成像部位，通常采用两个**的路径进行成像；对于相邻区域，通常使用单个物镜的多个光束进行成像。多光束扫描技术必须特别注意激发光束之间的串扰，这可以通过事后光源分离或时空复用来解决。事后光源分离法是指分离光束以消除串扰的算法；时空复用法是指同时使用多个激发光束，每个光束的脉冲在时间上被延迟，使不同光束激发的单个荧光信号可以暂时分离。引入的光束越多，可以成像的神经元越多，但多束会导致荧光衰减时间重叠增加，从而限制了分辨信号源的能力；并且复用对电子设备的工作速度要求很高；大量的光束也需要较高的激光功率来维持单束的信噪比，这样容易导致组织损伤。与传统的荧光显微镜相比，多光子显微镜具有更好的深度穿透能力和较低光损伤性，可以观察更深层的组织结构。
现代分子生物学技术的迅速发展和科技的进步，特别是随着后基因组时代的到来，人们已经能够根据需要建立各种细胞模型，为在体研究基因表达规律、分子间的相互作用、细胞的增殖、细胞信号转导、诱导分化、细胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物学条件。然而，尽管人们利用现有的分子生物学方法，已经对基因表达和蛋白质之间的相互作用进行了深入、细致的研究，但仍然不能实现对蛋白质和基因活动的实时、动态监测。在细胞的生理过程中，基因、尤其是蛋白质的表达、修饰和相万作用往往发生可逆的、动态的变化。目前的分子生物学方法还不能捕获到蛋白质和基因的这些变化，但获取这些信息对与研究基因的表达和蛋白质之间的相互作用又至关重要。因此，发展能用于、动态、实时、连续监测蛋白质和基因活动的方法非常必要。多光子显微镜是一种高分辨率的显微镜技术，利用多光子激发荧光的原理来观察生物样品的细胞结构和功能。美国共聚焦多光子显微镜成像深度
突破传统光学成像极限，多光子显微镜适应各种复杂环境。美国高速高分辨率多光子显微镜三维分辨率
多光子显微镜成像深度深、对比度高，在生物成像中具有重要意义，但通常需要较高的功率。结合时间传播的超短脉冲可以实现超快的扫描速度和较深的成像深度，但近红外波段的光本身会导致分辨率较低。基于多光子上转换材料和时间编码结构光显微镜的高速超分辨成像系统(MUTE-SIM)是由清华大学教授和北京大学彭研究员合作开发的。可实现50MHz的超高扫描速度，突破衍射极限，实现超分辨率成像。与普通荧光显微镜相比，该显微镜经过改进，只需要较低的激发功率。这种超快、低功耗、多光子超分辨率技术在高分辨率生物深层组织成像中具有长远的应用前景。美国高速高分辨率多光子显微镜三维分辨率
