单光子显微技术是较成熟的荧光显微技术，但由于其使用的激发光波长较短，成像深度有限；能量较大,会造成对荧光物质的漂白,光毒性严重。激光共焦扫描显微镜由于共焦显微镜的孔径很小,实现样本三维成像要逐点扫描,成像速度慢,对样本损害大,很难用于长时间活细胞成像。而宽场显微镜能够很好地实现实时动态成像,光漂白小,因而较早应用于活细胞内的实时检测，但宽场显微镜由于离焦信号的干扰,难以实现多维成像。Derrick想重点介绍一下较为常用的观察设备——双光子荧光显微镜（Two-PhotonLaser-ScanningMicroscopy）。双光子显微成像技术是近些年发展起来的结合了共聚焦激光扫描显微镜和双光子激发技术的一种新型非线性光学成像方法,采用长波激发，能对组织进行深层次成像。常用的比较好激发波长大多位于800-900nm，而水、血液和固有组织发色团对这个波段的光吸收率低，此外散射的激发光子不能激发样品，因此背景第，光损伤小，适用于在体检测。双光子荧光成像技术能准确定位细胞内置入的微电极位置，从而观察胞体、树突甚至单个树突棘的活性。研究者可完整的观察神经组织的分辨荧光图像,甚至可以分辨神经细胞单个树突棘中的钙分布。超微显微钙成像显微镜是研究活动动物神经活动必要仪器。上海荧光钙成像采购信息
钙是机体的组成元素之一。钙离子作为电流载体维持细胞内外的电化学梯度，同时在细胞的生命活动中扮演着重要角色。作为第二信使，钙参与细胞周期、细胞代谢、细胞分化、坏死、凋亡等等许多重要的生理过程。细胞内的钙离子水平通常很低，一般胞浆中的自由钙约为100nM。胞内的钙可被各种亚细胞器所贮存，据文献报道：其中约50%位于细胞核，30%位于线粒体，14%位于内质网，5%位于胞膜上，1%位于胞质内，且因为钙离子易与磷酸和碳酸复合物形成不溶物，故游离钙只占[1]。细胞可以通过钙内流、内钙释放及膜系统上的降钙蛋白等一整套完整的监控系统来维持细胞内钙的内稳状态。例如与钙内流相关的通道例如电压门控性钙离子通道VDCC、受体活跃的通道RACC；与内钙释放相关的受体如内质网上的IP3受体；以及降钙相关的脂膜及线粒体上的主动运输的钙泵系统等等[2]。近20年来钙的荧光成像及测定技术发展迅速，出现了各种各样的钙荧光指示剂，结合不断发展的显微成像系统，我们可以对活细胞的钙离子进行测定及成像，进一步揭示其生理机制及相关疾病的发病机制。钙成像的荧光指示剂钙成像的荧光探针一般均为Ca2螯合剂EGTA，APTRA，BAPTA的衍生物，它们可以结合钙离子从而显示一个光谱响应。合肥荧光钙成像动物行为学我们的钙成像系统集成自动控制和精确计时的多模式输入端口。
钙成像的荧光指示剂钙成像的荧光探针一般均为Ca2螯合剂EGTA，APTRA，BAPTA的衍生物，它们可以结合钙离子从而显示一个光谱响应，使研究者可以用荧光显微镜来观察细胞内的自由钙的浓度。荧光显微镜可以使用普通的倒置荧光显微镜来进行钙信号的测定和成像。并可结合电生理设备、活细胞培养装置等，适用于大强度、广范围的钙信号测定。共聚焦显微系统，共聚焦以激光为光源，且可配备氩离子光源，可以选择可见光激发的钙指示剂，进行层扫，相比普通荧光显微镜有更好的空间分辨率。并且共聚焦除了配备大视野扫描镜更可配置共振扫描振镜，以满足更高速成像应用的需求。双光子显微系统使用长波长来激发荧光指示剂，具有较低的细胞毒性，也可适用于紫外激发的钙指示剂，且可获得和单光子共聚焦系统类似的空间分辨率。小结综上可见，在研究钙信号时，可结合样品自身特点来选择相应的钙指示剂，并考虑既有的实验设备，来确定具体的实验方案。同时还需进一步摸索实验数据的校正、控制等多种影响因素，可获得可靠的图像及荧光定量数据。
随着功能光学成像技术的发展，神经学家们已经可以研究脑区和神经元内部的工作情况。功能钙成像技术就是其中之一，它的主要原理是将外源性荧光信号和生理现象耦合起来——通过荧光染料信号的改变反映细胞内游离钙离子浓度，通过这个变化来daibiao细胞的功能状态。目前这种技术被广泛应用于实时监测一群相关神经元内钙离子的变化，从而判断其功能活动。该技术的出现使得科学家可以亲眼目睹神经信号在神经网络之中时间和空间上的传递穿梭。双光子荧光显微镜能够在进行活动动物成像的时候实现高分辨率和高信噪比。
多种钙离子指示剂和钙成像手段的存在使研究人员能够根据具体的实验需要进行选择。同样，选择合适的检测设备也是至关重要的。对于使用CCD/sCMOS相机的成像系统来说，有两个要求是很基本的：采集速度：根据不同的应用所需的相机帧速也不同，对于神经细胞来说，一般要求相机速度至少在10fps以上，有些高速应用场景可能需要几百甚至上千Hz的帧速。灵敏度：为了尽可能降低光漂白和其他副作用（特别是蓝光激发时），需要降低激发光强度。因此相机要在较宽的发射光波长范围上具有高灵敏度，才能检测到弱光条件下的信号，并适应不同的染料的光谱发射特性。清醒动物脑功能钙成像的微型显微镜的研究在不断实践中。上海荧光钙成像采购信息
钙信号发挥着高度特异性的功能。上海荧光钙成像采购信息
近年来出现了通过植入性的microscope或microlens进行freelymoving动物钙成像的技术。如光纤成像法：使用一端带有GRINlens的光纤连接显微镜和动物大脑，从特定脑区发出的荧光信号被光纤收集，然后通过相机成像。动物头部只需植入GRINlens，方便活动，而且可以同时植入多个lens来观察不同的脑区之间的联系和相互作用。还有直接植入动物大脑的微型荧光显微镜，将GRINlens直接植入皮层下的海马，下丘脑，丘脑等区域，可以监测深部脑区的神经元活动。这种微型显微镜的重量只有几克，不会影响动物自由活动，可以提供800μm×600μm视野和1.50μm横向分辨率。上海荧光钙成像采购信息
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