随着技术的发展，双光子显微镜的性能得到不断地优化，结合它的特点，大致可以分成深和活两个方面的提升。深要想让激发激光进入更深的层面，大致可从两个方面入手，装置优化与标本改造。关于装置优化，我们可以把激光束变得更细，使能量更加集中，就能让激光穿透更深。关于标本，其中影响光传播的主要是物质吸收和散射，解决这个问题，我们需要对样本进行透明化处理。一种方法是运用某种物质将标本浸泡，使其中的物质（主要是脂质）被破坏或溶解。另一种方法是运用电泳将脂质电解，让标本“透明度”提高。高光子密度带来的高能量容易损伤细胞，所以双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲达到最大值所持续的周期只有十万亿分之一秒，而其频率可以达到80至100兆赫，这样即能达到双光子激发的高光子密度要求，又能不损伤细胞，使扫描能更好地进行。双光子显微镜的原理是什么？激光荧光双光子显微镜授权供应商
在深度组织中以较长时间对活细胞成像，双光子显微镜是当前之选。双光子和共聚焦显微镜都是通过激光激发样品中的荧光标记，使用探测器测量被激发的荧光。但是，共聚焦一般使用单模光纤耦合激光器，通过单光子激发荧光，而双光子使用飞秒激光器，通过几乎同时吸收两个长波光子激发荧光。下面是两种技术的对比图。双光子激发荧光的主要优势：双光子比共聚焦使用的更长的波长，所以对组织的损伤更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般为100微米，双光子则能达到250到500微米，甚至超过1毫米。另外，同时吸收两个光子意味只有较强度聚焦点处能被激发，所以不会损伤焦平面之外的组织，并且生成更清晰的图像。激光双光子显微镜成像视野一般是多少双光子显微镜已延伸到各个领域研究中，它能对样品进行三维观察。
双光子显微镜的应用由于适合动态成像，双光子显微镜一经问世便很快应用于神经科学、遗传发育、药物代谢等领域。双光子显微镜能够在细胞甚至是亚细胞水平上对***神经细胞的形态结构、离子浓度、细胞运动、分子相互作用等进行直接成像监测，而且能够进行光裂解、光转染和光损伤等光学操纵。同时，双光子显微镜能动态监测**在体内的生长和转移，并可对**治疗过程中*细胞的变化进行实时观测和评估。随着光学技术、荧光探针技术、计算机成像技术的发展，双光子显微技术会得到更大提升和更广的应用，未来不仅用于基础研究，也将扩展到临床应用。
共聚焦显微可以呈现这么漂亮的图像，是不是什么样品都可以用共聚焦显微镜拍拍拍.....得到各种各样清晰漂亮的图像呢？答案是否定的，任何事物都有优缺点，何况一台仪器呢，共聚焦显微镜也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦显微镜只能拍摄约200um以内的的样品，对于厚的或者样品不能进拍摄；2. 共聚焦显微镜由于是逐点进行扫描，对样品的光毒性还是比较大的，特别是拍摄活细胞样品时就更容易对样品进行淬灭；3. 由于光照射的区域几乎能通过这个Z轴的层面，所以对于空间定点光刺激的实验定点位置就不是特别精确；并且激光共聚焦显微镜没有纯紫外进行激发，对于一些特殊激发波长的实验，效率非常低。双光子显微镜不需要共聚焦，提高了荧光检测效率。
1990年初，当WinfriedDenk刚从康奈尔大学博士毕业准备前往瑞士读博后时，他看了一本关于激光扫描显微镜的书，从中了解到非线性光学效应——强光和物质的相互作用。当时，Denk有同事研究生物样品中的钙离子但苦于没有强大的紫外激光器和光学元件，于是他就想到如果使用双光子吸收就能够绕开紫外，换言之，与其通过一个紫外光子激发标记的钙离子，通过两个双倍波长的可见光光子也能激发相同的荧光。有了想法后马上实验。借了一套染料飞秒激光器，Denk联合他的导师WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六个小时就完成了实验搭建，采集数据则用了两到三天，于是一篇里程碑式的文章就此诞生了。双光子显微镜可以用于局部微蚀镭射磨皮后的胶原重塑的检测。布鲁克双光子显微镜图像对比度
双光子显微镜品牌有哪些？激光荧光双光子显微镜授权供应商
研究人员通过用不同激光波长并行化激光扫描（wavelengthmultiplexing），增加了相同时间内可以成像的体积，并同时保持较高的时间和空间分辨率。通过引入两种波长不同的钙信号荧光探针，研究人员将神经元群体的活动标记为两个不同颜色，并同时用两个不同波长的激光激发探针，实现了两个颜色的并行化数据记录。为了实现三维空间成像，研究人员还分别在两个激光光路上配置了快速变焦系统，分别为电可调节透镜（electricaltunablelens）和空间光调制器（spatiallightmodulator）。由此，可以同时以10赫兹的速度记录500微米500微米的10个平面，覆盖纵深达600微米，涵盖了从脑皮层第2层到第5层的结构，体积内记录到的神经元可以达到2000个以上。激光荧光双光子显微镜授权供应商
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