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聚合酶链式反应的常见问题：PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些很好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。假阴性：不出现扩增条带。PCR反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及溴乙锭的使用， PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。聚合酶链式反应的引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%。武汉特殊样本荧光PCR服务

聚合酶链式反应：RNA和DNA的五碳糖，前者比后者多了一个O，由于多出来的O原子造成了RNA和DNA的碱基不同，即O原子造成U和T的不同，U分子化学式C4H4N2O2，T胸腺嘧啶化学式C5H6N2O2，现在将两个分子式进行对比，U比T多了CH2，结合前面的核糖区别，还有一个O分子，其余结构相同，那么O和CH2之间的联系是什么?是什么导致DNA和RNA的区别是RNA比DNA多了O和CH2？或者说如何将病毒的碱基中U变成DNA碱基中的T？若从结构上说，直接从U中加入一个CH2，得到了T，这里面介入化学键的断裂和重组，但是这样一来的话，即使U变成了T，但是核糖依旧是RNA比DNA多了一个O分子，只是此时结构是某分子=核糖（C4H9O4CHO）+碱基（A T G C），形成了RNA的五碳糖+DNA的碱基这种分子了。此时将这种分子导入受体细胞（亦或者蛋白质）中，表达的性质一定不同于病毒表达的性质。武汉特殊样本荧光PCR服务热启动/冷完成聚合酶链反应是通过新的杂合聚合酶实现的，这些酶在环境温度下不活跃。

聚合酶链式反应的常见问题：Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。检测：PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是很常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。像所有酶一样，DNA聚合酶也容易出错，这反过来会导致产生的PCR片段发生突变。

聚合酶链式反应：三步：变性：模板DNA加热变性；复性，引物与它的靶序列发生退火，引物DNA量多，使引物和模板在局部形成杂交链；延伸，4种dNTP 与 Mg2+ 存在的条件下，DNA合成酶催化以引物为起始点，按5'-3'方向进行延伸。上面三步为一个循环，可使拷贝数到达2*E－6-2*E－7。PCR产物一段双链DNA，是由它的末端引物的5’端决定的。首轮扩增，其产物是大小不均一的DNA分子。长度应大于两引物之间的长度。在第二个循环中，由于5'固定，其产物长度就由等于两引物之间的长度。所以几十个循环后就会产生大量的两引物之间序列。聚合酶链反应可以选择这些突变来理解蛋白质是如何完成其功能的，并改变或改善蛋白质功能。广州细胞RT-PCR检测技术原理

聚合酶链反应很容易理解和使用，并迅速产生结果。武汉特殊样本荧光PCR服务

聚合酶链式：PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2-4分钟，2-3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。　PCR技术敏感性高，特异性强，操作简便、快速，在生命科学研究、食品卫生、医疗、法医及环境监测等诸多方面都具有重要的应用价值。武汉特殊样本荧光PCR服务