广州基因编辑技术脱靶检测

gRNA的长度和错配： 17个核苷酸长度的gRNA显示出更高的基因组编辑效率。相比之下，18-20 bp的长度显示出较低的基因组编辑效率。在人类细胞中减少潜在脱靶效应的指导方针：1) 应避免在PAM的7-10 bp范围内靶序列有超过3个错配；2) 在PAM的12 bp内，应避免sgRNA 凸起以减少脱靶效应。gRNA的化学修饰：在gRNA核糖磷酸骨架中加入2ʹ-O-甲基-3ʹ-膦酰基乙酸酯会导致位点特异性修饰，使脱靶切割减少40-120倍，同时保持靶向性能。gRNA上游5'发夹结构的修饰可以提高Cas9和Cas12的特异性，降低脱靶效应。如何降低脱靶效应？选择特异的gRNA； 使用RNP； 使用eSpCas9的质粒； 使用Nickase Cas9。广州基因编辑技术脱靶检测

CIRCLE-seq原理。细胞内检测方法由于提纯的基因组已经消化去除了组蛋白，结构较细胞内的染色质更为松散，理论上容易找到更多的脱靶位点。为捕获CRISPR在细胞内工作时真实发生的脱靶切割，研究者们也设计了一些细胞内的脱靶位点检测方法。1) Guide-seqCRISPR造成DNA双链断裂后，由于DNA修复机制的存在，断裂处很快就会重新连接，这时候提纯基因组DNA很难保留CRISPR造成的DNA断裂位点。所以为了记录细胞内真实的CRISPR脱靶切割，研究者们设计了Guide-seq[10]，利用NHEJ的DNA修复机制，将一段双链短核苷酸序列（dsODN）连接到CRISPR造成的DNA双链断裂处，相当于连接了一轮接头，然后再正常打断基因组，在另一侧连接第二轮接头。通过这种方式构建的文库，就可以获取脱靶位点一侧的序列。虽然每次CRIPSR导致的DNA双链断裂并不一定都会连接dsODN，但反过来说，越容易连接dsODN的位点，其发生脱靶切割的概率越高。通过Guide-seq找到的脱靶位点偏少，但一般都是可信度较高的脱靶位点，Guide-seq也是目前比较公认的一种脱靶检测方法。武汉种子脱靶检测guide-sequence内基因编辑技术可能造成的脱靶效应,建立了一种被命名为GOTI。

R-loop seq虽然不是一种真正意义上的脱靶位点检测方法，但能为碱基编辑脱氨酶的脱靶提供一种度量方法，以便于之后的脱氨酶点突变优化，来降低脱靶的发生几率。2) Detect-seqCRISPR衍生技术由于其复杂性，检测其脱靶位点的hexin思路是捕获实验过程中的关键中间产物或者终产物。这种设计思路下，目前较为成功的是检测碱基编辑CBE脱靶位点的Detect-seq[13]。CBE的原理是将dC脱氨变为dU，迫使其对侧的dG变为dA，较终将碱基对从C-G转变为T-A。Detect-seq便是针对中间态的dU，使用Uracil DNA Glycosylase (UDG)，去除U碱基后，替换为带Biotin的U碱基，捕获碱基编辑的脱靶位点，并且sgRNA依赖和sgRNA不依赖的脱靶位点都能找到。该方法类似检测DNA甲基化的重亚硫酸盐测序法，通过处理特定的碱基，可以捕获全基因组上的CBE脱靶位点。

先导编辑器：CBE和ABE组合使用可以有效地进行4种碱基转换（C→T, G→A, A→G, T→C），而无需产生DSB，然而除了这4种碱基转换，对另外8种碱基转换（C→A, C→G, G→C, G→T, A→C, A→T, T→A, T→G）以及碱基的插入和缺失，依然缺乏有效的研究工具。先导编辑器（Prime Editor, PE），PE在不依赖DSB和供体DNA的条件下便可有效实现所有12种碱基转换，此外还能有效实现多碱基的精细插入（较多可插入44bp）和删除（较多删除80bp）。> 抗CRISPR蛋白。抗CRISPR（Acr）蛋白是天然的CRISPR/Cas系统抑制剂，由各种可移动遗传元件（MGEs）编码，在不同阶段抑制CRISPR-Cas的免疫功能。已经发现了多达45个Acr蛋白，其中 "AcrIIA4 "有可能保护细胞免受编辑。Shin和他的同事发现，通过调整AcrIIA4或Cas9加入实验的时间，AcrIIA4将脱靶修饰减少了4倍，而没有减少靶向效应。脱靶检测企业，推荐唯可生物，实验实力强，专业性高，检测效率高，结果准确率高。

基因编辑产品除了适用基因zhiliao产品的一般考虑以及整合性载体的特殊考虑外，长期随访中还应额外关注脱靶风险，量化评估脱靶活性和在靶活性之间的相关性，或利用在靶活性来预测脱靶活性的水平。在开发过程中应同时关注基因转导效率、脱靶效率、插入突变情况、目的基因在靶细胞中整合位点及表达。评估基因zhiliao产品整合进基因组的可能性，判断是否需要开展另外的遗传毒性研究，评估插入突变（插入位点、插入拷贝数等）引起的遗传毒性风险。需要关注脱靶编辑、转座子转座印迹引起的遗传毒性问题；鉴定/表征基因组整合位点。非临床研究是药物开发的重要环节之一。脱靶检测简单有效的方法之一是全基因组测序法。广州基因编辑技术脱靶检测

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降低CRISPR脱靶效应，你可以做什么？CRISPR技术是一种简单而强大的编辑基因组的工具。它使研究人员能够轻松地改变DNA序列并修改基因功能。它的许多潜在应用包括纠正遗传缺陷，zhiliao和预防疾病的传播，以及改善农作物。在流行的用法中，CRISPR是CRISPR-Cas9的简写。CRISPRs是“有规律地间隔的短回文重复序列”的缩写。它是DNA的一个特殊区域，有两个明显的特征：存在核苷酸重复和间隔物。核苷酸的重复序列分布在整个CRISPR区域。间隔物是穿插在这些重复序列中的DNa pian段。广州基因编辑技术脱靶检测