温州分子生物学定量PCR方案

聚合酶链式反应生物学研究的历史中占据了重要的地位。以此为基础发展出包括Real-time PCR在内的多项应用技术。自诞生后Real-time PCR技术持续发展，从简单的增扩到整个PCR过程，Real-time PCR表现出比PCR更敏感、更明确的定量分析特性和对识别等位基因的能力。不少人以为real-time就是意味着可以在显示器上看到每个循环增扩曲线的增长。事实并非如此，早期的软件不能在运行期间提供可视化的增扩曲线。主要是因为SDS软件采用整个平台较终的数据执行数据分析工作，而不是分析每个单独的反应循环。对某些设备来说，必须向分析软件提供实时的数据，有些设备则不需要。前一种设备允许软件实时跟踪每个加样口的增扩曲线，同时显示在电脑屏幕上。Real-time PCR与普通PCR的实验目的不同，所以对引物的设计要求也不同。温州分子生物学定量PCR方案

Real-time PCR实验注意事项-防止RNA酶污染的措施：1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。4.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6.设置RNA操作专业使用实验室，所有器械等应为专业使用。特殊样本数字PCR实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测聚合酶链式反应循环后产物总量的方法。

Real-time PCR-传统定量PCR：扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，之后酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。

Real-time PCR：基线（baseline)：通常是3－15个循环的荧光信号，同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线。阈值（threshold)：自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。Ct值：与起始浓度的对数成线性关系，分析定量时候一般取Ct:15-35.太大或者太小都会导致定量的不准确。相对定量：通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因之间的表达差异,一般是2-△△Ct。或者是考虑扩增效率的Pfaffl法。Real-time PCR在实验过程中为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。

聚合酶链式反应准备：PCR引物设计，PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。引物设计的基本原则：引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC很好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。聚合酶链反应为这些技术提供了大量的纯DNA，有时是单链的。特殊样本数字PCR

Real-time PCR从用途上分可以分为定性分析和定量分析。温州分子生物学定量PCR方案

Real-time PCR从用途上分可以分为定性分析和定量分析：定性分析指的是用于分析待检测的样本中是否存在我们想要检测的成分，即待检测成分有无的分析。通常，定性分析可以应用于病毒以及病原菌的检测，物种鉴定以及基因分型等。病毒及病原菌检测，如SARS、H1N1病毒，都可以通过Real-time PCR的方法进行高灵敏度的检测，定性分析样本是否已被病毒传播。物种鉴定如我们国家的一些检验检疫机构，想要检测进口的牛肉制品中是否含有鸡源、猪源或鸭源等成分，或者用于检测羊奶中是否会掺有牛奶等等，可以通过Real-time PCR的方法进行检测。基因分型，如啤酒型，肥胖型基因的检测，就是Real-time PCR在基因分型方面的应用。温州分子生物学定量PCR方案

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